乙型肝炎病毒耐药的研究进展
成　军
北京地坛医院传染病研究所，北京100011

　　慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒治疗的地位和作用已经得到了确立，未来几年这一领域的发展方向就是新型NA的研发。随着对CHB抗病毒治疗临床研究的不断深入，在核苷（酸）类似物（NA）抗乙型肝炎病毒（HBV）治疗临床研究中发现HBV的耐药是一个普遍和突出的问题，只有充分重视HBV耐药的研究，才能更有效地贯彻长期抗病毒治疗的方针。
一、乙型肝炎病毒耐药的一些基本概念
　　HBV的基因耐药（genetic resistance）是指CHB患者血中的HBV基因序列出现了耐药相关的基因突变。如果检测到了HBV DNA耐药相关的基因序列，那么这种基因耐药肯定是存在的；如果检测结果阴性，却不能完全排除存在耐药基因变异病毒的可能性。在CHB患者血中检测到了耐药相关的基因突变，把变异的HBV DNA实现全基因克隆化，构建真核表达载体，体外转染肝癌细胞系，进行NA 的EC50/IC50的测定，如与野生株相比克隆的病毒株对药物的敏感性降低4倍以上，可确定为表型耐药（phenotypic resistance）。表型耐药是体外试验结果的一种描述。HBV DNA的反弹（rebound）或者称为突破（breakthrough）是指CHB患者在抗病毒治疗过程中，HBV DNA载量较最低水平上升1log10。ALT水平从正常值上限显著上升、或者在原来基础上出现ALT水平的显著升高，称为ALT波动（flare），这反映了由于病毒复制水平增加，导致肝脏炎症活动，表现为血清ALT水平升高。临床恶化（deterioration或exacerbation）是CHB患者因为病毒复制和肝脏炎症加剧，导致临床症状和体征的加剧或恶化。针对一种药物的耐药基因突变，同时对于另外一种无关的药物也出现耐药现象，称为交叉耐药（cross resistance）。交叉耐药产生是有其结构基础的，是交叉耐药相关药物耐药基因位点的接近或重叠造成的。
二、乙型肝炎病毒耐药的一些基本理论
　　为什么在抗病毒治疗过程中会出现耐药？主要原因是HBV自身复制能力很强，每24小时可以复制1012~13个拷贝，在复制的逆转录过程中，逆转录酶缺乏严格校正机制，自发突变率达10-5。HBV突变是绝对的，遗传是相对的。HBV感染的几十年中，积累了大量的基因序列突变的HBV病毒株，而有些病毒的基因变异恰好位于HBV DNA聚合酶的区域，就会产生耐药。以前认为，突变病毒株复制能力比野生型病毒复制能力有下降，但是目前认为HBV DNA突变对于病毒复制能力的影响是多种多样的：或降低其复制能力，或提高其复制能力，或没有影响。在没有NA抗病毒治疗的时候，各种病毒株在病毒群中所占的比例，主要由各种病毒复制能力等因素所决定。NA抗病毒治疗时，各种病毒因对药物敏感性不同，从而在病毒群中的相对比例就会开始出现差别。对于NA抗病毒治疗敏感的病毒株，因为受到选择性的压力其在病毒群中的绝对数和相对比例会逐渐减少，而耐药的病毒株绝对数影响不大，但相对比率逐渐上升。因此，经过抗病毒药物的选择，最终耐药病毒株从劣势种群逐渐演变成优势种群。在很多情况下，特别是感染了HBV很长时间的CHB患者，在血清中存在着各种各样的病毒株，只是比例不同。由于目前扩增HBV DNA序列的技术，都是依赖于PCR扩增技术，而PCR扩增技术是基于引物与模板之间的竞争性结合，因此，PCR阳性的结果，依赖于被扩增的模板在病毒群中所占的相对比例。简单说就是被扩增的特定病毒株必须在病毒群中的相对比例，必须达到最低的阈值。因此，基于PCR原理的HBV DNA扩增结果，如果获得了变异的病毒株，可以肯定变异病毒株的存在，但是，检测结果的阴性，则并不能完全排除变异病毒的存在，或许只存在少量的变异病毒，而没有达到其阈值，PCR扩增出现了假阴性而已。因此，对于HBV DNA检测结果必须有一个更为客观的认识。
　　耐药研究提出了基因屏障（genetic barrier）和药代动力学屏障（pharmacodynamic barrier）的学说。不同的药物耐药的产生，决定于不同的基因序列的变异。如果只要出现一种或者一个位点的基因变异就产生耐药，就比同时出现多个为突变才产生耐药更容易一些，这就是所谓的基因屏障。因为NA抗病毒治疗对病毒复制抑制程度不同，而耐药病毒的产生，主要是因为药物抑制病毒复制的活性不彻底，如果一种药物对于无论野生型还是耐药病毒的复制能力都有很强的抑制作用，病毒的复制水平维持在很低的水平，产生耐药病毒的可能性就很小。这就是所谓的药代动力学屏障。药代动力学屏障的另外一层含义就是，早期抑制病毒的能力越强，产生耐药病毒的可能性就越小。这在所有的NA的临床研究中都是如此。将病毒的复制水平越早降低到检测不到的水平，耐药产生的可能性就越小。因此，临床上所应用的NA，抑制病毒的作用越强、越快，产生耐药的机会就越小。当然，这些因素不是产生耐药的全部决定因素，CHB患者临床耐药的产生是由病毒、机体免疫力、药物作用的特点等综合的因素来决定的。
　　HBV准种特点的研究对于理解CHB患者临床耐药的形成过程和临床特点具有很大的帮助和意义。从准种特点来看，任何CHB患者血液中的HBV都是以不同种群存在的，种群的性质和特点，主要取决于病毒群不同组分的复制能力和机体的免疫力之间相互作用最终达到的一种平衡的结果。但是，开始应用NA进行抗病毒治疗时，这种平衡就被打破了，在药物选择的作用下，形成了新的平衡，各种病毒种群所占的相对比率也进行了新的调整。优势种群和不同的劣势种群存在着一种转换，称之为种群的的漂变（shift）。应用HBV准种的理论理解NA抗病毒治疗中的一些变化规律，非常有价值。
三、乙型肝炎病毒耐药的处理原则
　　自从1999年拉米夫定在中国上市，超过120万CHB患者曾经应用拉米夫定进行抗病毒治疗，目前拉米夫定耐药即YMDD结构域突变的耐药的临床处理是摆在我们面前的一项重要任务。拉米夫定耐药产生的比例随着治疗时间的延长而显著升高，1~5年的耐药率分别为20%、38%、49%、66%、69%。早期的研究表明，如果出现拉米夫定耐药，拉米夫定与阿德福韦酯重叠用药1~3个月后停用拉米夫定，与拉米夫定联合阿德福韦酯的临床疗效没有差别，但18个月以后，两药联合治疗的方案就显示出优势：更好的疗效，更低的针对阿德福韦酯的耐药。因此，更多的临床资料表明拉米夫定联合阿德福韦酯的方案对于长期抗病毒治疗来说可能更为合理[1]。恩替卡韦抗病毒治疗，应该用1.0mg/日的治疗剂量。当然，针对拉米夫定耐药，也可以改用干扰素特别是聚乙二醇化干扰素治疗。将来可以选择其他的新型核苷类似物如泰诺福韦等。
　　阿德福韦酯的耐药，主要是N236T或A181V的变异，因为与拉米夫定的YMDD位点没有重叠，因此，出现阿德福韦酯的耐药，应用拉米夫定是有效的。但拉米夫定对N236T突变株有效，对A181V突变株的敏感性下降。阿德福韦酯治疗5年的基因耐药、表型耐药和临床耐药的比率分别为29%、16%、11%，显著低于拉米夫定的耐药率[2]。N236T耐药可选恩替卡韦或替比夫定治疗，而A181V突变对拉米夫定、恩替卡韦的敏感性有所下降，对泰诺福韦具有很好的敏感性。
恩替卡韦临床应用时间尚短。初步临床结果表明，未经核苷类似物治疗的患者在恩替卡韦治疗96周后，较少有耐药的发生，拉米夫定耐药患者在恩替卡韦治疗48周后，大约7%的患者出现恩替卡韦的耐药。对于恩替卡韦耐药患者，加用或换用阿德福韦酯或泰诺福韦[3]。
针对多种NA的都耐药的所谓的多重耐药，随着NA的长期应用势必要出现。但是，针对多重耐药的处理原则还有待于进一步的临床研究[4]。
四、乙型肝炎病毒耐药研究存在的问题
　　目前对于NA耐药的临床研究可谓刚刚开始，对于许多现象和规律的认识还很初步，需要进行大量的临床研究和实验研究。我们对HBV药物敏感性和耐药性的特点和产生规律的研究和认识也刚刚开始。也正因为如此，目前我们在CHB患者临床抗病毒治疗的药物选择方面还存在着很大的盲目性。我们还没有像指导临床抗生素应用的体外药敏实验系统，抗病毒药物的选择缺乏很好的循证医学的证据。对于病毒种群的认识、对于病毒耐药的认识，必将进一步推动这方面的进展。将来的发展方向，就是最大程度地了解病毒种群的性质，病毒种群对于不同药物敏感性的差别，病毒种群对于不同药物耐药的差别，并最终产生检测不同病毒种群的高通量技术，来指导抗病毒药物的选择[5]。有了这样的客观的临床依据，必将促进抗病毒药物的正确选择，也必将会大幅度提高抗病毒治疗的疗效。

参考文献
1　Yatsuji H, Noguchi C, Hiraga N, et al. Emergence of a novel lamivudine-resistant hepatitis B virus variant with a substitution outside the YMDD motif. Antimicrob Agents Chemother,2006; 50(11):3867-3874
2　Hadziyannis SJ, Tassopoulos NC, Heathcote EJ, et al. Long-term therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B for up to 5 years. Gastroenterology,2006;131(6):1743-1751
3　Colonno RJ, Rose R, Baldick CJ, et al. Entecavir resistance is rare in nucleoside naive patients with hepatitis B. Hepatology,2006;44(6):1656-1665
4　Villet S, Pichoud C, Villeneuve JP, et al. Selection of a multiple drug-resistant hepatitis B virus strain in a liver-transplanted patient. Gastroenterology,2006;131(4):1253-1261